L'IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) est un analogue du substrat de la β-galactosidase, fortement inductible. Sous l'effet de l'IPTG, l'inducteur forme un complexe avec la protéine répressive, modifiant ainsi la conformation de cette dernière et l'empêchant de se lier au gène cible. Ce dernier est alors exprimé efficacement. Dès lors, comment déterminer la concentration d'IPTG optimale lors de l'expérience ? Une concentration plus élevée est-elle préférable ?
Tout d'abord, comprenons le principe de l'induction par l'IPTG : l'opéron lactose d'E. coli contient trois gènes de structure, Z, Y et A, codant respectivement pour la β-galactosidase, la perméase et l'acétyltransférase. lacZ hydrolyse le lactose en glucose et galactose, ou en allolactose ; lacY permet au lactose présent dans le milieu de culture de traverser la membrane cellulaire et de pénétrer dans la cellule ; lacA transfère le groupe acétyle de l'acétyl-CoA au β-galactoside, ce qui neutralise l'effet toxique de l'IPTG. De plus, on trouve une séquence opératrice O, une séquence d'initiation P et un gène régulateur I. Ce dernier code pour une protéine répressive qui se lie à la position O de la séquence opératrice, réprimant ainsi l'opéron (méta) et inhibant son expression. Il existe également un site de liaison pour la protéine activatrice des gènes cataboliques (CAP) en amont de la séquence d'initiation P. Les séquences P et O, ainsi que le site de liaison de CAP, constituent ensemble la région régulatrice de l'opéron lac. Les gènes codant pour les trois enzymes sont régulés par cette même région afin d'assurer l'expression coordonnée des produits géniques.
En l'absence de lactose, l'opéron lac (méta) est réprimé. Dans ce cas, le répresseur lac, exprimé par la séquence I sous le contrôle du promoteur PI, se lie à la séquence O, empêchant ainsi l'ARN polymérase de se fixer à la séquence P et inhibant l'initiation de la transcription. En présence de lactose, l'opéron lac (méta) peut être induit. Dans ce système, le lactose n'est pas l'inducteur direct. Une fois dans la cellule, le lactose est transformé en allolactose par la β-galactosidase. Ce dernier, en tant que molécule inductrice, se lie à la protéine répressive et modifie sa conformation, ce qui entraîne la dissociation de la protéine répressive de la séquence O et la transcription. L'isopropylthiogalactoside (IPTG) a le même effet que l'allolactose. C'est un inducteur très puissant, non métabolisé par les bactéries et très stable, ce qui explique son utilisation fréquente en laboratoire.
Comment déterminer la concentration optimale d'IPTG ? Prenons E. coli comme exemple.
La souche d'E. coli BL21 génétiquement modifiée, contenant le plasmide recombinant positif pGEX (CGRP/msCT), a été inoculée dans un milieu liquide LB contenant 50 µg·mL⁻¹ d'ampicilline et cultivée pendant une nuit à 37 °C. Cette culture a ensuite été inoculée dans 10 flacons de 50 mL de milieu liquide LB frais contenant 50 µg·mL⁻¹ d'ampicilline, à un ratio de 1:100, pour la culture d'expansion. Lorsque la densité optique à 600 nm (DO600) atteignait 0,6 à 0,8, de l'IPTG a été ajouté à la concentration finale. Les concentrations utilisées étaient de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 et 1,0 mmol·L⁻¹. Après induction à la même température et au même moment, 1 mL de la solution bactérienne a été prélevé, et les cellules bactériennes ont été collectées par centrifugation et soumises à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE) pour analyser l'influence de différentes concentrations d'IPTG sur l'expression des protéines, puis sélectionner la concentration d'IPTG avec la plus grande expression protéique.
Après des expériences, il s'avère que la concentration d'IPTG ne doit pas être maximale. En effet, l'IPTG présente une certaine toxicité pour les bactéries. Une concentration excessive peut entraîner la mort cellulaire. De manière générale, on souhaite qu'une plus grande quantité de protéines solubles soit exprimée dans la cellule, ce qui est bénéfique. Cependant, dans de nombreux cas, une concentration d'IPTG trop élevée provoque la formation d'inclusions importantes, tandis que la quantité de protéines solubles diminue. Par conséquent, la concentration optimale d'IPTG est souvent plus faible que la concentration la plus élevée.
L'induction et la culture de souches génétiquement modifiées visent à augmenter le rendement de la protéine cible et à réduire les coûts. L'expression du gène cible dépend non seulement des facteurs propres à la souche et du plasmide d'expression, mais aussi de conditions externes telles que la concentration de l'inducteur, la température et la durée d'induction. Par conséquent, avant d'exprimer et de purifier une protéine inconnue, il est généralement préférable d'étudier la durée, la température et la concentration d'IPTG afin de sélectionner les conditions optimales et d'obtenir les meilleurs résultats expérimentaux.
Date de publication : 31 décembre 2021