Il existe de nombreux héros méconnus autour de nous, qui semblent ordinaires, mais qui, en réalité, contribuent grandement à notre bien-être. La protéinase K est l'un de ces héros méconnus du secteur du diagnostic moléculaire. Bien que moins visible que d'autres acteurs majeurs du secteur, son importance a longtemps été sous-estimée. Avec l'apparition de la pandémie de COVID-19, la demande en protéinase K a explosé, tandis que l'offre, tant nationale qu'internationale, était largement insuffisante. C'est alors que chacun a pris conscience de son rôle crucial.
À quoi sert la protéinase K ?
La protéinase K est une sérine protéase dotée d'une activité protéolytique et capable de la conserver dans une large gamme de conditions environnementales (pH 4-12,5, tampons à forte concentration saline, température élevée de 70 °C, etc.). De plus, son activité n'est pas inhibée par le SDS, l'urée, l'EDTA, le chlorhydrate de guanidine, l'isothiocyanate de guanidine, etc., et une certaine quantité de détergent peut même l'accroître. La protéinase K trouve des applications dans divers domaines : traitement médical (désinfection virale et microbienne), agroalimentaire (attendrissement de la viande), tannage (assouplissement du cuir), vinification (clarification de l'alcool), préparation d'acides aminés (dégradation des plumes), extraction d'acides nucléiques, hybridation in situ, etc. Son application la plus courante est l'extraction d'acides nucléiques.
La protéinase K peut hydrolyser tous types de protéines présentes dans l'échantillon, y compris les histones fortement liées aux acides nucléiques, permettant ainsi la libération de ces derniers dans l'extrait et facilitant les étapes ultérieures d'extraction et de purification. Lors de la détection d'acides nucléiques viraux, la protéinase K est un composant essentiel de la solution de prélèvement viral. Elle peut cliver et inactiver la capside virale, ce qui garantit la sécurité du transport et de la détection. De plus, la protéinase K peut dégrader la RNase, empêchant ainsi la dégradation de l'ARN viral et facilitant la détection des acides nucléiques.
La célébrité soudaine de la protéinase K
Que ce soit dans le domaine de la recherche scientifique ou dans celui du diagnostic in vitro (DIV), l'extraction d'acides nucléiques est une expérience fondamentale, et la protéinase K y a toujours joué un rôle crucial. Pourtant, par le passé, son importance était largement méconnue. Cela s'explique en grande partie par la grande stabilité de l'offre et de la demande en protéinase K. Rares étaient ceux qui imaginaient que son approvisionnement puisse poser problème.
Avec l'apparition de la pandémie de COVID-19, la demande de tests d'amplification des acides nucléiques (TAAN) a explosé. Fin juin 2020, la Chine avait réalisé près de 90 millions de tests, un chiffre encore plus alarmant à l'échelle mondiale. Lors des extractions d'acides nucléiques, la concentration de protéinase K utilisée est d'environ 50 à 200 µg/mL. En général, 100 µg de protéinase K sont nécessaires pour extraire un échantillon. En pratique, afin d'optimiser l'extraction, on utilise souvent une quantité plus importante de protéinase K. La détection du nouveau coronavirus a engendré une forte demande en protéinase K. L'équilibre initial entre l'offre et la demande a été rapidement rompu, et la protéinase K est devenue du jour au lendemain un outil essentiel de lutte contre l'épidémie.
Difficultés de production de la protéinase K
Bien que l'importance de la protéinase K ait été reconnue avec l'évolution de l'épidémie, il est regrettable que, du fait de sa faible popularité, peu d'entreprises nationales se soient lancées dans sa production. Lors de la mise en place de cette production, il est apparu que la protéinase K est une protéine très particulière, rendant extrêmement difficile l'augmentation rapide des capacités de production.
La production à grande échelle de protéinase K se heurte aux difficultés suivantes
1. Faible expression
La protéinase K peut dégrader de manière non spécifique la plupart des protéines et induire une toxicité importante dans la cellule hôte d'expression. Par conséquent, son niveau d'expression est généralement très faible. Le criblage des systèmes d'expression et des souches surexprimant la protéinase K nécessite généralement un cycle plus long.
2. Résidus de pigments et d'acides nucléiques
La fermentation à grande échelle introduit une quantité importante de pigments et de résidus d'acides nucléiques de l'hôte. Il est difficile d'éliminer ces impuretés par un simple procédé de purification, et une purification complexe augmente les coûts et réduit le taux de récupération.
3. Instabilité
La protéinase K n'est pas suffisamment stable, elle peut s'auto-enzymolyser, et il est difficile de la conserver de manière stable à 37°C pendant une longue période sans agent protecteur.
4. Facile à précipiter
Lors de la préparation de la poudre lyophilisée de protéinase K, afin de garantir une teneur élevée en matière sèche de protéinase K dans la poudre lyophilisée, il est nécessaire d'ajouter un agent protecteur lyophilisé à forte concentration. Cependant, lorsque la concentration de protéinase K atteint 20 mg/mL et plus, une agrégation se forme facilement, entraînant la formation d'un précipité, ce qui complique considérablement la lyophilisation de la protéinase K à forte teneur en matière sèche.
5. Investissement important
La protéinase K possède une forte activité protéasique et peut hydrolyser d'autres protéases en laboratoire. Par conséquent, sa production, son développement et sa fabrication nécessitent des zones de production, des équipements et du personnel spécialisés.
Solution de protéinase K de XD BIOCHEM
XD BIOCHEM dispose d'une plateforme mature d'expression et de purification de protéines, et bénéficie d'une solide expérience dans l'expression et la purification de protéines recombinantes ainsi que dans l'optimisation des procédés de production. Grâce à la mise en place rapide d'une équipe de recherche et développement, la production à grande échelle de protéinase K a été maîtrisée. La production mensuelle de poudre lyophilisée dépasse 30 kg. Le produit présente des performances stables, une activité enzymatique spécifique élevée et est exempt de cytochromes et de résidus d'acides nucléiques de l'hôte. Contactez XD BIOCHEM pour obtenir un kit d'essai (E-mail :sales@xdbiochem.comTél : +86 513 81163739).
Les solutions techniques de XD BIOCHEM comprennent
L'intégration de plasmides multicopies permet de sélectionner des souches à forte expression avec un niveau d'expression de 8 g/L, ce qui résout le problème du faible niveau d'expression de la protéinase K.
Grâce à la mise en place d'un processus de purification en plusieurs étapes, les résidus de cytochrome hôte et d'acide nucléique de la protéinase K ont été éliminés avec succès en dessous de la valeur standard.
Grâce à un criblage à haut débit de formulations de tampons protecteurs, un tampon capable de conserver de manière stable la protéinase K à 37 °C a été sélectionné.
Le criblage des tampons permet de surmonter le problème de l'agrégation et de la précipitation faciles de la protéinase K à des concentrations élevées, et jette les bases de la lyophilisation à haute teneur en solides de la protéinase K.
Échantillon de protéinase K XD BIOCHEM
Test de stabilité de la protéinase K XD BIOCHEM : aucune modification significative de l’activité ne sera observée après 80 jours à température ambiante.
Test de stabilité de la protéinase K XD BIOCHEM : aucune modification significative de l’activité ne sera observée après 80 jours à température ambiante.
Comparaison de l'efficacité d'extraction d'acides nucléiques de la protéinase K XD BIOCHEM et de produits concurrents. Lors de l'extraction d'acides nucléiques, la protéinase K XD BIOCHEM et une protéinase K concurrente ont été utilisées. L'efficacité d'extraction de la protéinase K XD BIOCHEM est supérieure et la valeur Ct du gène cible est inférieure.
Date de publication : 31 décembre 2021